蛋白质组学的发动机：质谱仪这十年为什么突然变快了？

导读
在第一篇里，我们说蛋白质组学正在从“测到蛋白”，走向“读懂生命状态”。但这个跃迁有一个最基础的前提：你得先把蛋白质组测得足够快、足够深、足够稳。
过去十年，质谱平台升级不只是“扫描更快”，而是离子源、分离系统、采集策略、质量分析器、数据系统和自动化工作流一起变强。

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01｜质谱仪为什么是蛋白质组学的“发动机”？

蛋白质组学面对的不是一个整齐的分子清单，而是一锅极其复杂的肽段混合物。

一个细胞或组织样本经过蛋白提取、酶切之后，会变成成千上万甚至更多肽段。这些肽段丰度差异巨大：有的信号强到“闪瞎眼”，有的信号弱到几乎被背景噪音淹没。它们还会在液相色谱中短暂地流出，在几秒甚至更短的时间里，被质谱仪捕捉、选择、碎裂、检测和记录。

换句话说，质谱仪要做的事情有点像在高速公路上识别车辆：

• 车流密集；
• 速度很快；
• 车型复杂；
• 还要尽可能不漏掉低调但重要的那辆车。

过去十年，蛋白质组学之所以突然变快，一个核心原因就是这台“发动机”变强了。

它不只是扫描更快，而是整个 LC-MS/MS 系统都在升级：

这一篇的核心问题是：
质谱平台这十年到底发生了什么，为什么它让蛋白质组学从“深但慢”，走向“又快又深”？

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02｜质谱仪到底在蛋白质组学里做什么？

要理解质谱平台升级，先要知道质谱仪在蛋白质组学中的角色。

在最常见的 bottom-up proteomics 中，研究者不会直接把完整蛋白一个个拿去测，而是先把蛋白质用胰蛋白酶等酶切成肽段。然后，这些肽段进入液相色谱系统，根据疏水性等性质依次流出，再进入质谱仪。

质谱仪大致要完成四件事：

1. 把肽段变成带电离子。
2. 测量这些离子的质荷比，也就是 m/z。
3. 选择一部分离子进行碎裂，生成碎片离子。
4. 根据母离子和碎片离子的谱图，推断它们来自哪些肽段和蛋白。

这听起来像一个线性流程，但真正的难点在于：所有事情都必须在非常短的时间窗口内完成。

液相色谱中的肽段峰不是一直存在的。一个肽段可能只在几十秒甚至几秒内达到可检测浓度。如果质谱仪扫描太慢，它就会错过很多离子；如果选择策略不够好，它会反复测强信号，而漏掉弱信号；如果灵敏度不够，低丰度蛋白就会消失在背景里。

所以，质谱平台升级的本质，是在有限时间内回答一个问题：

如何用更少的时间，捕获更多有用离子，并把它们转化成更可靠的蛋白信息？

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03｜早期瓶颈：不是没有蛋白，而是来不及测

在蛋白质组学中，一个常见误解是：样本里没有检测到某个蛋白，就代表这个蛋白不存在。

实际上，很多时候不是不存在，而是没有被质谱仪有效采到。

在传统 DDA，也就是数据依赖采集中，质谱仪会先做一次 MS1 扫描，看到当前有哪些母离子，然后挑选其中信号较强的一部分做 MS/MS 碎裂。这种策略非常适合发现型分析，但它有一个天然限制：质谱仪只能在一个采集循环里选择有限数量的离子。

当样本复杂度很高时，质谱仪面对的是大量同时洗脱的肽段。强信号肽段更容易被选中，弱信号肽段可能被跳过。不同样本中被选中的肽段也可能不完全一致，这就带来了 missing value 和重复性问题。

因此，早期蛋白质组学提升性能的一个直接方向，就是提高“测序速度”：

在同样的液相色谱时间里，尽可能多地产生高质量 MS/MS 谱图。

2014 年，Q Exactive HF 相关研究展示了超高场 Orbitrap 在扫描速度上的进步：该平台可以达到 20 Hz 以上的测序速度，并在 1 小时梯度、1 μg HeLa digest 条件下鉴定约 4400 个蛋白，相比前代仪器约提升 30%。这类工作代表了当时“更快扫描带来更深覆盖”的典型路线。[1]

但随着样本量和问题复杂度继续增加，单纯“扫描更快”还不够。蛋白质组学需要的不只是快，还要在快的同时保持灵敏度、准确度和可重复性。

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04｜Orbitrap 路线：高分辨率和高质量谱图的长期积累

过去十多年，Orbitrap 是蛋白质组学中最重要的质谱分析器路线之一。

Orbitrap 的核心思想，可以追溯到 Alexander Makarov 在 2000 年发表的工作：离子在静电场中围绕中心电极运动，并沿轴向做谐振振荡，振荡频率与 m/z 有关，由此实现高性能质量分析。[2]

对蛋白质组学来说，Orbitrap 的吸引力在于：

• 高分辨率：更清楚地区分相近 m/z 的离子；
• 高质量准确度：更准确地给出质量信息；
• 较好的动态范围：更适合复杂样本中的肽段鉴定和定量；
• 平台持续迭代：从深度发现型研究，逐步走向高通量应用。

此后，Orbitrap 平台不断迭代：更高场强、更快扫描、更紧凑的仪器结构、更好的离子传输和更适合高通量应用的前端设计。2009 年的高场 Orbitrap 研究显示，通过提高电场强度，可以在固定采集时间内获得更高分辨率。[3]

到 2020 年，Orbitrap Exploris 480 与 FAIMS、Evosep One 等系统结合，已经开始面向短梯度和高通量蛋白质组学。相关研究显示，DIA-FAIMS 结合短 LC 梯度可以在 20 分钟内定量超过 5000 个蛋白组，并支持每天 60 个样本的分析；在 5 ng HeLa digest、5 分钟梯度条件下，也可重复鉴定超过 1000 个蛋白。[4]

这说明，Orbitrap 路线的发展不只是“分辨率越来越高”，而是在向两个方向同时推进：

一方面，它继续服务深度蛋白质组学。
另一方面，它开始适应短梯度、大样本量、低输入和临床队列。

这对蛋白质组学非常重要。因为过去很多深度实验可以做，但很难规模化；而现在，越来越多平台开始追求“日常可运行的大规模蛋白质组学”。

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05｜TOF 与离子淌度：给质谱增加一个“第三维度”

另一条重要路线，是 TOF 质谱与离子淌度，尤其是 TIMS 和 PASEF 的结合。

TOF，也就是飞行时间质谱，本身具备非常高的采集速度。它的基本思路是：离子在电场中被加速后进入飞行管，不同 m/z 的离子飞行时间不同，由此被区分。速度快，是 TOF 的天然优势。

但蛋白质组学的难题不只是快。

复杂肽段混合物里，很多离子会在色谱上共洗脱，在 m/z 上也可能靠得很近。于是，研究者希望在液相色谱和 m/z 之外，再增加一个分离维度。

这就是离子淌度的价值。

离子淌度可以根据离子在气相中的形状、大小和电荷状态进行分离。换句话说，两个 m/z 接近的离子，如果空间构型不同，也可能在离子淌度维度上被区分开。这相当于给蛋白质组学数据增加了一个额外坐标。

TIMS，也就是 trapped ion mobility spectrometry，是近年来非常重要的实现方式之一。TIMS 可以把离子在气流和电场之间“困住”，再按淌度顺序释放。PASEF 则进一步利用 TIMS 中离子释放的时间顺序，在一次淌度扫描中同步选择多个前体离子进行碎裂。

2018 年的 timsTOF Pro / PASEF 研究显示，PASEF 可以在不牺牲灵敏度的情况下实现超过 100 Hz 的 MS/MS 采集速度；在 120 分钟 HeLa digest 单针分析中，MaxQuant 可鉴定超过 6000 个蛋白；在 10 ng HeLa digest、30 分钟分析中，也可鉴定超过 2500 个蛋白。[5]

这个结果背后的意义，不只是一个速度数字。

PASEF 解决的是一个长期矛盾：扫描越快，单张谱图可积累的离子越少，灵敏度可能下降。而 PASEF 通过“平行积累、串行碎裂”的方式，让离子利用更高效，从而在速度和灵敏度之间取得更好的平衡。

也就是说，质谱仪不只是跑得更快了，而是更聪明地利用了进入仪器的离子。

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06｜diaPASEF：当 DIA 遇上离子淌度

PASEF 的下一步，是和 DIA 结合。

DIA 的核心思想是系统性采集，而不是只挑最强的离子。它更适合大队列和稳定定量。问题在于，DIA 会产生更复杂的混合碎片谱图，对选择性和数据解析提出更高要求。

diaPASEF 的意义就在这里：它把 DIA、PASEF 和 TIMS 的离子淌度维度结合起来，利用 m/z 和离子淌度两个维度设计采集窗口。

2020 年发表的 diaPASEF 研究指出，传统 DIA 虽然覆盖预设 m/z 范围，但总体上只有少数进入仪器的离子会被隔离用于质量分析；diaPASEF 利用肽段分子量和离子淌度之间的相关性，在 m/z 和 mobility 窗口中最高可采样接近 100% 的肽段前体离子电流，并在全蛋白质组和混合物样本中展示了较深覆盖、较高重复性和定量准确度，即使在 10 ng 样本量下也能工作。[6]

这件事对蛋白质组学的推动很大。

因为它让“高通量 DIA”不只是算法问题，也变成了硬件和采集方式协同优化的问题。离子淌度提供了额外分离维度，PASEF 提升了离子利用率，DIA 提供了更稳定的数据矩阵。三者结合，使得复杂样本的快速、深度、可重复定量更可行。

这也解释了为什么我们要把“质谱平台升级”和“DIA 采集策略”分成两篇讲：

硬件给了 DIA 更强的基础，DIA 也反过来推动硬件朝更高速度、更高离子利用率和更复杂数据结构演进。

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07｜Orbitrap Astral：超高速平台把“又快又深”推向前台

如果说过去十年质谱平台升级有一个非常鲜明的近年节点，那就是 Orbitrap Astral 这类超高速平台的出现。

Orbitrap Astral 将四极杆-Orbitrap 系统与 Astral 分析器结合。Astral 的关键卖点不是单纯“更高分辨率”，而是高灵敏度、低离子损失和非常快的 MS/MS 扫描速度。

2023 年发表在 Nature Biotechnology 的 nDIA 研究显示，Orbitrap Astral 结合 narrow-window DIA，可以实现约 200 Hz 的并行 MS/MS 扫描速度。该工作报告，在半小时梯度中可达到约 1 万个人类蛋白组深度，在 5 分钟梯度中约 7000 个蛋白；每天可分析 48 个人类蛋白质组或超过 100 个酵母蛋白质组。[7]

这类数字之所以重要，是因为它改变了蛋白质组学实验设计的边界。

以前，如果想要深度覆盖，常常需要长梯度、复杂分级和较长机时。这样当然可以做出漂亮数据，但不适合几百上千个样本。

现在，超高速平台让研究者可以重新权衡“深度”和“通量”。比如：

2024 年的 Orbitrap Astral 磷酸化蛋白质组研究显示，利用 Orbitrap Astral 与 DIA，可以在约半小时数据采集内绘制约 3 万个独特人类磷酸化位点，并在 12 小时测量中检测到 81,120 个独特磷酸化位点，用于构建小鼠多组织磷酸化蛋白质组图谱。[8]

这说明，超高速平台不只是让常规蛋白质组学变快，也开始影响修饰组学、信号通路研究和动态扰动实验。

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08｜别只看质谱仪：液相色谱和自动化同样关键

在蛋白质组学里，质谱仪很像发动机，但只换发动机不一定能让车跑得好。

前端液相色谱、样本上样方式、梯度稳定性、柱系统、自动化和运行鲁棒性，同样决定了一个实验能不能真正规模化。

过去深度蛋白质组学常常依赖长梯度 nano-LC。长梯度有利于分离复杂肽段，但也意味着每个样本占用更多时间。如果一个样本需要 2 小时，1000 个样本就会变成巨大的机时负担。

因此，高通量蛋白质组学需要短梯度、高稳定性和低运行开销。

Evosep One 是过去几年常被提到的高通量 LC 平台之一。其核心思路是把样本加载、脱盐和预制梯度等步骤标准化，以提高运行鲁棒性和样本通量。相关应用资料显示，这类系统可以通过并行化进样间步骤、减少运行开销，支持每天数十到数百个样本的高通量工作流；例如，短梯度工作流可在约 20 分钟量级定量数千个蛋白。[9]

这给我们一个重要提醒：

蛋白质组学变快，不是质谱仪单独完成的。

真正的高通量来自整套系统：

• 样本制备要能批量化；
• 液相色谱要能短梯度且稳定；
• 质谱仪要能高速采集；
• 数据分析要能快速处理；
• 质控体系要能发现批次漂移。

任何一个环节跟不上，都会成为瓶颈。

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09｜质谱平台十年路线图：从更快扫描到真实应用

把这些技术放在一条时间线上，会更容易看出主线：

2014：超高场 Orbitrap

代表性关键词是扫描速度提升。更快的高分辨率 MS/MS 采集，让深度 DDA 蛋白质组学更有效率。

2018：timsTOF Pro / PASEF

代表性关键词是离子淌度进入主流。PASEF 通过平行积累、串行碎裂，在速度和灵敏度之间取得更好的平衡。

2020：FAIMS、diaPASEF、短梯度 LC

代表性关键词是多维分离与高通量工作流加速。DIA、离子淌度、FAIMS、短梯度 LC 和自动化系统开始更紧密地协同。

2023：Orbitrap Astral + nDIA

代表性关键词是超高速 MS/MS。超高速平台把“又快又深”推到前台，重新打开深度和通量的边界。

2024：复杂应用扩展

代表性关键词是从平台能力走向真实问题。快速深度磷酸化蛋白质组、临床队列、大规模扰动实验和复杂样本分析，都开始受益于新一代平台。

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10｜质谱平台升级带来了什么新能力？

过去十年质谱平台升级，至少带来了五种能力变化。

1. 从“深但慢”到“又快又深”

过去，深度覆盖往往意味着长时间分析。现在，高速 Orbitrap、TOF、PASEF、diaPASEF、nDIA 和短梯度 LC 共同推动了“深度”和“通量”的同时提升。Orbitrap Astral / nDIA 的结果就是典型例子：半小时约 1 万人类蛋白、5 分钟约 7000 个蛋白，让过去很难兼得的深度和速度开始同时出现。[7]

2. 从“多用样本”到“少量样本也能测”

灵敏度提升让微量样本、激光显微切割组织、稀有细胞群、低输入临床样本更可行。FAIMS-DIA 在 5 ng HeLa digest、5 分钟梯度下可重复鉴定超过 1000 个蛋白，PASEF 也在 10 ng HeLa digest 中展示了数千蛋白级别的覆盖能力。[4,5]

3. 从“二维分离”到“多维分离”

传统 LC-MS 主要依赖液相保留时间和 m/z。加入离子淌度后，数据中多了一个与离子大小、形状和电荷相关的维度。TIMS / PASEF 相关研究显示，离子淌度不仅可以提高分离能力，还可以提供碰撞截面积 CCS 等额外物理化学信息。[5]

4. 从“发现型测量”到“规模化定量”

DIA、diaPASEF、nDIA 和高速平台结合后，蛋白质组学更容易产出完整、稳定、可比较的数据矩阵。这对临床队列、药物筛选和系统生物学非常关键。diaPASEF 研究也强调了深度覆盖、重复性和定量准确度在复杂样本中的表现。[6]

5. 从“专家操作”到“平台化运行”

高通量 LC、自动化样本制备、标准化梯度、稳定采集方法和成熟软件，使蛋白质组学逐渐从少数专家实验室的“手艺活”，走向更可复制的平台技术。这一点对临床转化尤其重要，因为临床研究需要的不只是漂亮结果，还需要长期稳定运行。

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11｜但发动机变强，不等于没有挑战

质谱平台升级很令人兴奋，但也要避免把问题讲得过于简单。

挑战一：速度和深度仍然需要权衡

5 分钟、20 分钟、60 分钟梯度适合的问题不同。短梯度适合高通量筛选和队列，长梯度更适合深度机制研究。不能用一个指标判断所有平台。

挑战二：更快采集会带来更复杂的数据

DIA、diaPASEF、nDIA 的数据解析高度依赖算法。硬件越强，数据量越大，对软件、数据库、谱图库、深度学习模型和质控流程的要求也越高。

挑战三：仪器性能不等于生物学解释

多鉴定几千个蛋白，不自动等于发现了机制。蛋白质组学真正的价值，仍然要回到实验设计、样本质量、统计分析和生物学验证。

挑战四：平台间比较要谨慎

不同仪器、不同梯度、不同样本量、不同数据库、不同软件和不同 FDR 控制策略，都会影响“鉴定多少蛋白”的结果。公众号文章可以讲趋势，但科研实践中不能只看标题数字。

这也是为什么蛋白质组学技术发展到今天，越来越强调标准化、质控和可重复性。

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12｜结语：质谱仪变快，本质是离子利用效率变高

如果用一句话总结过去十年质谱平台的跃迁，我会这样说：

蛋白质组学变快，不只是因为质谱仪扫描更快，而是因为我们越来越会珍惜每一个进入仪器的离子。

Orbitrap 路线提升了高分辨率、高质量准确度和高速 MS/MS 能力。

TOF 和 TIMS / PASEF 路线提高了采集速度和离子利用率。

diaPASEF 把离子淌度、PASEF 和 DIA 连接起来，让系统性采集更高效。

Orbitrap Astral 让超高速 MS/MS 和 narrow-window DIA 把“又快又深”推到新阶段。

短梯度 LC 和自动化系统则把这些能力真正变成可用于大队列的工作流。

所以，质谱平台升级不是单个硬件参数的胜利，而是一场系统工程。

这台发动机变强之后，蛋白质组学才有可能从少量样本的深度探索，走向大规模、低输入、空间化、临床化和动态生命状态解析。

下一篇预告
从 DDA 到 DIA：为什么蛋白质组学从“看见更多”，走向“量得更稳”？

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参考文献与延伸阅读

[1] Kelstrup, C. D. et al. Performance evaluation of the Q Exactive HF mass spectrometer for proteomics. Journal of Proteome Research (2014). https://pubs.acs.org/doi/10.1021/pr500985w

[2] Makarov, A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: a high-performance technique of mass analysis. Analytical Chemistry (2000). https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac991131p

[3] Makarov, A., Denisov, E. & Lange, O. Performance evaluation of a high-field Orbitrap mass analyzer. Journal of the American Society for Mass Spectrometry (2009). https://pubs.acs.org/doi/10.1016/j.jasms.2009.01.005

[4] Bekker-Jensen, D. B. et al. A compact quadrupole-Orbitrap mass spectrometer with FAIMS interface improves proteome coverage in short LC gradients. Molecular & Cellular Proteomics (2020). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7124470/

[5] Meier, F. et al. Parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-dependent acquisition and trapped ion mobility mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics (2018). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6283298/

[6] Meier, F. et al. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nature Methods (2020). https://www.nature.com/articles/s41592-020-00998-0

[7] Messner, C. B. et al. Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition. Nature Biotechnology (2023). https://www.nature.com/articles/s41587-023-02099-7

[8] Lancaster, J. D. et al. High-speed, high-depth phosphoproteomics using the Orbitrap Astral mass spectrometer. Nature Communications (2024). https://www.nature.com/articles/s41467-024-51274-0

[9] The Analytical Scientist / Bruker application note. High-throughput 4D-proteomics: application of dia-PASEF and the Evosep One for short gradients (2020). https://www.theanalyticalscientist.com/app-notes/2020/high-throughput-4d-proteomics-application-of-dia-pasef-and-the-evosep-one-for-short-gradients